Caveolinas y modulación del sistema del óxido nítrico en el hipotiroidismo según avanza la edad / Age-related Influence of Hypothyroidism on Caveolins and Nitric Oxide Modulation

Introducción El hipotiroidismo y la edad impactan sobre la producción de óxido nítrico (NO) cardíaco y renal. Las caveolinas, moduladores negativos de la actividad enzimática de la NO sintetasa (NOS), se afectan con ambos factores. Objetivos Evaluar la implicación de las caveolinas (cav) en la modulación de la actividad de la NOS cardíaca y renal en animales hipotiroideos adultos. Material y métodos Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley eutiroideas e hipotiroideas [metimazol 0,02% (v/v) en el agua de bebida durante 28 días]. Los animales fueron sacrificados para extraer el corazón y los riñones. Resultados La actividad de la NOS en la aurícula derecha disminuyó con la edad y el hipotiroidismo. La expresión de cav-1 aumentó con la edad y el hipotiroidismo. La actividad de la NOS en el ventrículo izquierdo aumentó con el avance de la edad y el hipotiroidismo. La expresión de ambas caveolinas disminuyó en los grupos adulto e hipotiroideo. En la médula renal, el hipotiroidismo disminuyó la actividad de la NOS en jóvenes y la aumentó en adultos. La expresión de cav-1 disminuyó con la edad y en jóvenes hipotiroideos. Los niveles proteicos de cav-3 disminuyeron en animales adultos hipotiroideos. Conclusiones El hipotiroidismo impacta sobre la actividad de la NOS y de sus moduladores, las caveolinas, en el sistema cardiovascular y renal. El hipotiroidismo intensifica los efectos del avance de la edad en ambos sistemas.

Introduction Hypothyroidism and age impact on cardiac and renal nitric oxide (NO) production. Caveolins, which are negative modulators of NO synthase (NOS) activity, are affected by both factors. Objectives The aim of this study was to evaluate caveolin (CAV) participation in the modulation of renal and cardiac NOS activity in adult hypothyroid animals. Methods Euthyroid and hypothyroid [methimazole 0.02% (v/v) in the drinking water during 28 days] male Sprague-Dawley rats were used. Animals were sacrificed to remove the heart and kidneys. Results Right atrial NOS activity decreased with age and hypothyroi-dism. Caveolin-1 expression increased with age and hypothyroidism. Conversely, left ventricular NOS activity increased with aging and hypothyroidism and the expression of both CAV isoforms decreased in adult and hypothyroid groups. In the renal medulla, hypothyroidism reduced NOS activity in young and raised it in adult animals and CAV-1 expression decreased with age and in hypothyroid young animals. Caveolin-3 protein levels decreased in adult hypothyroid animals. Conclusions Hypothyroidism impacts on NOS activity and on that of its modulators, caveolins, in the cardiovascular and renal systems. Hypothyroidism enhances the effects of aging in both systems.

Caveolinas cardíacas y modulación de la óxido nítrico sintetasa durante el estado hipovolémico según avanza la edad / Age-Related Changes of Cardiac Caveolins and Nitric Oxide Synthase Modulation during Hypovolemic State / Age-Related Changes of Cardiac Caveolins and Nitric Oxide Synthase Modulation during Hypovolemic State

Introducción El óxido nítrico (NO) es uno de los factores que se estimulan durante el estado hipovolémico. Las caveolinas afectarían la producción de NO en el corazón según avanza la edad. Objetivo Investigar la interacción entre la caveolina-1 (cav-1) y la óxido nítrico sintetasa endotelial (eNOS) en ventrículos de ratas jóvenes y adultas sometidas a hemorragia aguda. Material y métodos Se utilizaron ratas Sprague-Dawley machos jóvenes (2 meses de edad) y adultas (12 meses de edad). Se conformaron dos grupos experimentales de cada grupo etario (jóvenes y adultas): Control y Hemo (sangrado: 20% de la volemia). Los animales se sacrificaron para la extracción del ventrículo izquierdo. Resultados Luego del sangrado, la actividad de la NOS aumentó el 21% y el 45% en ratas jóvenes y el 32% y el 56% en adultas. El Western blot reveló que los niveles de eNOS fueron menores (31%) en ratas adultas. La hemorragia ocasionó un aumento del 147% de la eNOS a los 60 min en animales jóvenes y del 66% en adultos, atenuándose a los 120 min. La colocalización mostró un patrón difuso de localización de la eNOS asociado con cav-1 en animales del grupo Control jóvenes. En el grupo Hemo, a los 60 min se observó un patrón de disociación, el cual fue parcialmente restablecido a los 120 min. En los animales adultos del grupo Control se observó un patrón de localización de la eNOS y cav-1 con una disociación mayor que en las ratas jóvenes. Esta característica se observó también luego de los 60 y los 120 min. Conclusión El aumento de la producción de NO ante un estado hipovolémico se ve condicionado por la presencia de cav-1, la cual cumple un papel preponderante en el proceso del envejecimiento.

Background Nitric Oxide (NO) is one of the factors activated by hypovolemic state. Caveolins might affect the production of NO with increasing age. Objective To investigate the interaction between caveolin-1 (cav-1) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in the ventricles of young and adult rats subjected to acute bleeding. Material and Methods We used young (2 months old) and adult (12 months old) male Sprague-Dawley rats. The animals from each age group (young and adult) were divided into two experimental groups: Control: control group, and Hem: bleeding group (20% of blood volume). The animals were sacrificed and the left ventricle was resected. Results After bleeding, NOS activity increased by 21% and 45% in young rats and by 32% and 56% in adult rats. Western blot analysis revealed that NOS levels were lower (31%) in adult rats. Sixty minutes after bleeding, eNOS activity increased by 147% in young animals and by 66% in adults, with lower increase at 120 minutes. Colocalization showed a diffuse pattern of eNOS location associated with cav-1 in group Control of young animals. A dissociation pattern was observed in group Hem at 60 min which was partially restored at 120 min. The dissociation pattern of eNOS and cav-1 in group Control adult animals was greater compared to that of young rats. This characteristic was also seen after 60 min and 120 min. Conclusion The increased production of NO during hypovolemic state depends on the presence of cav-1 which plays a key role in the aging process.

Shock hemorrágico: óxido nítrico en ratas anestesiadas y no anestesiadas / Hemorrhagic Shock: Nitric Oxide in Anesthetized and Non Anesthetized Rats

Antecedentes En un trabajo previo mostramos que el estado hipovolémico inducido por una pérdida aguda de sangre se acompaña de una activación dinámica, heterogénea y dependiente del tiempo de la óxido nítrico sintetasa (NOS) cardíaca. Este sistema estaría involucrado en las alteraciones hemodinámicas que se observan luego de la depleción de volumen sanguíneo. Objetivo El objetivo del presente trabajo fue evaluar la participación del sistema del óxido nítrico (NO) mitocondrial en la respuesta adaptativa del sistema cardiovascular ante un shock hipovolémico en ratas anestesiadas y no anestesiadas. Material y métodos El estudio se llevó a cabo con cuatro grupos de animales (n = 7 por grupo): grupo A, ratas control anestesiadas; grupo C, ratas control no anestesiadas; grupo AH, ratas anestesiadas sometidas a una hemorragia (20% de la volemia) y grupo CH, ratas no anestesiadas sometidas a una hemorragia. Se evaluaron el consumo de oxígeno, la actividad funcional de la NOS mitocondrial (mtNOS) y la producción mitocondrial de NO. Resultados No se observaron diferencias significativas entre los valores de control respiratorio en los distintos grupos estudiados. La actividad funcional de la mtNOS fue menor en el grupo AH respecto del grupo A (12 ± 2 y 19 ± 1, respectivamente). Este efecto fue de menor magnitud cuando la hemorragia se provocó en animales no anestesiados (17 ± 1 y 20 ± 1, respectivamente). La producción mitocondrial de NO disminuyó en los grupos sometidos a una pérdida aguda de sangre, tanto no anestesiados como anestesiados, respecto de los animales controles. Conclusiones El sistema del NO mitocondrial estaría involucrado en la respuesta de adaptación del sistema cardiovascular frente a la depleción aguda de volumen. Esta participación dependería del grado de anestesia del animal.

Background We have previously demonstrated that hypovolemia induced by acute bleeding is accompanied by a dynamic, heterogenous and time-dependent activation of the cardiac nitric oxide synthase (NOS). This system might be involved in the hemodynamic anomalies observed after blood volume depletion. Objective To assess the role of the mitochondrial nitric oxide (NO) system in the adaptive response of the cardiovascular system in anesthetized and non anesthetized rats under hypovolemic shock. Material and Methods Animals were divided in four groups (n=7 animals per group): Group A, anesthetized control rats; group C, non anesthetized control rats; group AB, anesthetized rats subjected to bleeding (20% of blood volume), and group CB, non anesthetized rats subjected to bleeding. Oxygen consumption, functional activity of mitochondrial NOS (mtNOS) and mitochondrial production of NO were assessed. Results There were no significant differences in the values of respiratory parameters among the different study groups. Group AB had less functional activity of mtNOS compared to group A (12±2 and 19±1, respectively). This effect was even lower in non anesthetized animals subjected to bleeding (17±1 and 20±1, respectively). Mitochondrial production of NO decreased in anesthetized and non anesthetized animals with acute bleeding compared to controls. Conclusions Mitochondrial NO system might be involved in the adaptive response of the cardiovascular system under acute volume depletion, depending on the animal's degree of anesthesia.

Modulación de la abundancia de acuaporinas 2 en el riñón de la rata: efecto del óxido nítrico durante el estado hipovolémico / Aquaporin-2 Abundance Modulation in the Kidney of the Rat: The Effect of Nitric Oxide During the Hypovolemic State

Hemos demostrado que el shock hemorrágico induce un incremento en la actividad de la enzima óxido nítrico sintetasa, isoforma específica y dependiente del tiempo. Dicha activación estaría involucrada en la modulación de la función cardiovascular. Parecería que la inhibición del sistema del óxido nítrico previene el aumento de la frecuencia cardíaca que se observa en las fases tardías del estado hipovolémico inducido por una pérdida aguda de sangre. En este estudio planteamos la hipótesis de que la inhibición del sistema del óxido nítrico altera la expresión y/o la localización de las acuaporinas 2 en los túbulos colectores renales de ratas sometidas a una hemorragia. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho, divididas en cuatro grupos (n =15 por grupo): a) normotensas (grupo N), b) hipovolémicas (hemorragia 20% volemia) (grupo H), c) normotensas y tratadas con N G-nitro-L-arginina metil éster (grupo L-NAME N) y d) hipovolémicas y tratadas con el inhibidor (grupo LNAME H). La distribución y la expresión de las acuaporinas 2 se determinaron mediante análisis inmunohistoquímico y Western blot a los 120 minutos del sangrado. La hemorragia indujo un incremento en la expresión de las acuaporinas 2 a los 120 minutos del sangrado. La inmunolocalización mostró que las acuaporinas 2 se ubicaron en el citoplasma de las células principales de los túbulos colectores renales de las ratas sometidas a hemorragia. La inhibición del óxido nítrico aumentó los niveles de acuaporinas 2, principalmente en la membrana apical. Se demuestra así que el sistema del óxido nítrico estaría asociado con una disminución progresiva de la expresión de las acuaporinas 2 que contribuye a la alteración de la capacidad de concentración de la orina en respuesta al shock hemorrágico.

We have previously demonstrated that hemorrhagic shock induces a time-dependent increase in the activity of nitric oxide synthase specific isoform. Such activation might be involved in modulation of cardiovascular function. It seems that the inhibition of the nitric oxide system prevents hemorrhage- induced heart rate changes seen in late stages of hypovolemic shock. The objective of this study was to assess if the inhibition of the nitric oxide system alters aquaporin-2 expression and/or location in the collecting-duct systems in kidneys of bleeding rats. Male Sprague-Dawley rats were used, divided in four groups (n = 15 for each group): a) normotensive rats (group N), b) hypovolemic rats (animals subjected to a 20% loss of the total volemia) (group H), c) normotensive rats pretreated with the nitric oxide synthase inhibitor N G-nitro-L-arginine- methyl ester (group L-NAME N), and d) hypovolemic rats pretreated with the inhibitor (group L-NAME H). The distribution and the expression of aquaporin-2 were assessed 120 minutes after bleeding by immunohystochemical and Western blot analysis. An increase in aquaporin-2 expression was seen 120 after blood loss. Immunolocation showed aquaporin-2 inside the cytoplasm of collecting-duct main cells in kidneys of bleeding rats. Nitric oxide inhibition increased aquaporin-2 levels, especially in the apical membrane. Thus, the nitric oxide system might be associated with a progressive decrease in the expression of aquaporin-2 which may alter urine concentration as a response to hemorrhagic shock.

El estado hipovolémico modula la actividad y la expresión de la óxido nítrico sintetasa en el sistema cardiovascular / Hypovolemic state modulates nitric oxide synthase activity and expression in the cardiovascular system

Previamente mostramos que el pretratamiento con el inhibidor de la óxido nítrico sintetasa, NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), revierte la hipotensión y anula los cambios en la frecuencia cardíaca inducidos por la hemorragia. Objetivo: Evaluar la actividad histoquímica (técnica NADPH-diaforasa) y la expresión (Western blot) de la óxido nítrico sintetasa en la aurícula derecha y en el ventrículo izquierdo de animales sometidos a una hemorragia del 20 por ciento de la volemia. Material y métodos: Se conformaron cuatro grupos de animales (n = 14, por grupo): S ( sham ), H (hemorragia), SL-NAME ( sham + L-NAME) (0,5 mg/kg/h IV = 100 µl/h) y HL-NAME (hemorragia + LNAME). El sacrificio de los animales se realizó por decapitación a los 60 y a los 120 min posteriores al sangrado y se extrajo el corazón para su estudio. Resultados: La pérdida de sangre aumentó la actividad de la NOS en la aurícula y en el ventrículo a los 60 y 120 min (aurícula: 8 por ciento y 21 por ciento respectivamente; ventrículo: 21 por ciento y 45 por ciento, respectivamente) del sangrado. El análisis de Western blot con empleo de un anticuerpo antióxido nítrico sintetasa inducible reveló la presencia de dicha proteína en la aurícula y en el ventrículo a los 120 min del sangrado (654 ± 13 y 465 ± 9 unidades arbitrarias, respectivamente). La expresión de la óxido nítrico sintetasa endotelial aumentó en la aurícula y en el ventrículo a los 60 min (18 por ciento y 147 por ciento respectivamente) en comparación con S, normalizándose a los 120 min de la hemorragia. Conclusiones: El estado hipovolémico inducido por una hemorragia del 20 por ciento de la volemia está asociado con un patrón heterogéneo y dinámico de regulación de la actividad y de la expresión de la óxido nítrico sintetasa en el tejido cardíaco.